水质 浮游植物的测定显微镜计数法 (意见征求稿)

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2021-04-01
简介
水质 浮游植物的测定显微镜计数法 (意见征求稿)发布,详情如下:

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水质浮游植物的测定显微镜计数法(意见征求稿)1适用范围本标准规定了测定水中浮游植物的显微镜计数法。本标准适用于地表水中浮游植物的测定。当使用0.1ml计数框,样品浓缩50倍时,对角线方式方法检出限为9.2×103cells/L;行格方式方法检出限为3.0×103cells/L;全片方式方法检出限为9.2×102cells/L;随机视野方式的方法检出限与观察的视野数、显微镜视野面积有关,按附录A计算。2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本标准。HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ494水质采样技术指导3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1浮游植物phytoplankton在水中营浮游生活的藻类植物,通常浮游植物就是浮游藻类,包括原核的蓝藻门和其它各类真核藻类。3.2显微镜计数视野microscopecountingfield显微镜视野中一定面积的计数区域。3.3检出限detectionlimit在99%概率下,样品中可被检测到的最低浮游植物密度。4方法原理在显微镜下,对样品中的浮游植物进行人工分类和计数,计算单位体积样品中各种类浮游植物的细胞数量。5试剂和材料除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂,实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。5.1碘化钾(KI)。5.2碘(I2)。5.3甲醛溶液:ω(CH2O)=37%。5.4鲁哥氏液(Lugolssolution)称取60g碘化钾(5.1),溶于1000ml水中,再加入40g碘(5.2),充分搅拌使其溶解,静置24h以上。鲁哥氏液在室温避光条件下可保存1年。6仪器和设备6.1浮游生物网:25号筛绢网,网孔直径为0.064mm,网呈圆锥形,网口套在铜环上,网底端有出水开关活塞。6.2采样瓶:30ml棕色玻璃广口瓶(具塞)。6.3显微镜:物镜4×、10×、20×、40×,目镜10×或15×。6.4浓缩装置:筒形分液漏斗,1L。6.5样品瓶:50ml的棕色玻璃广口瓶(具塞)。6.6超声波发生装置:工作频率40kHz。6.7微量移液器:100μl。6.8藻类计数框:0.1ml、面积20mm×20mm,框内划分横直各10行格,共100个小方格。6.9盖玻片:面积22mm×22mm,厚度小于0.2mm。6.10计数器。6.11显微镜物镜测微尺。6.12显微镜目镜测微尺。6.13一般实验室常用仪器和设备。7样品7.1样品的采集7.1.1定性样品使用浮游生物网(6.1)采集定性样品。关闭浮游生物网底端出水开关活塞,在水面表层至0.5m水深处(或根据研究需要确定的其他水深),以20cm/s——30cm/s的速度缓慢做“∞”形往复拖动约1min——3min;也可沿表层至0.5m水深处缓慢拖动,滤过1.5m3——5.0m3体积的水体。将浮游生物网(6.1)提出水面,水体自然通过网孔,待底部还剩少许水体(5ml——10ml)时,将底端出口伸入采样瓶(6.2)中,打开底端活塞收集定性样品。7.1.2定量样品按照HJ/T91和HJ494的相关规定进行样品的采集。一般采集不少于500ml样品。当水体中的浮游植物密度小于106cells/L,采集不少于1L样品。7.2样品的保存7.2.1定性样品定性样品在4℃——10℃冷藏避光条件下可保存36h。高温环境下采集的定性样品在保存前需逐渐降温,避免温度变化过快对浮游植物细胞产生损伤。7.2.2定量样品向每1000ml定量样品中加入15ml鲁哥氏液(5.4)。室温避光条件下可保存3周;1℃——5℃冷藏避光条件下可保存12个月。样品在保存过程中,应每周检查鲁哥氏液的氧化程度,如果样品颜色变浅,则应向样品中补加适量鲁哥氏液,直到样品的颜色恢复为黄褐色。若定量或定性样品含大量有机质、需储存12个月以上时,应加入甲醛溶液(5.3)固定,每100ml样品加4ml甲醛溶液(5.3)。8分析步骤8.1混匀样品每次取样前,必须采用上下颠倒至少100次的方式充分混匀所采样品。8.2定性样品的分析在显微镜(6.3)下观察定性样品(7.1.1),鉴定浮游植物的种类,并建立清单,为定量分析做好准备。根据调查的需要,确定需鉴定到的分类单位,一般情况下,鉴定到属即可。8.3定量样品的分析8.3.1调整浮游植物密度8.3.1.1样品浓缩当定量样品(7.1.2)中的浮游植物细胞密度小于107cells/L时,需要对样品进行浓缩。样品中浮游植物细胞密度为105cells/L——106cells/L时,样品浓缩50倍;样品中浮游植物细胞密度为106cells/L——107cells/L时,样品浓缩10倍。最终使浓缩后加入计数框中的0.1ml样品约含有500个——10000个浮游植物细胞。样品中浮游植物细胞密度的初步判断可参照显微镜计数(8.3.2)进行。将全部定量样品摇匀倒入浓缩装置(6.4)中,静置48h。用细小虹吸管吸取清液置于烧杯中,直至浮游植物沉淀物体积约20ml。旋开浓缩装置(6.4)底部活塞,将浮游植物沉淀物放入100ml量筒中。用少许清液冲洗浓缩装置(6.4)1——3次,一并放入量筒中,再用清液定容至所需浓缩倍数的体积。为了减少浮游植物吸附在浓缩装置壁上,在静置过程中,应适时轻敲浓缩装置器壁。8.3.1.2样品稀释当定量样品(7.1.2)中的浮游植物细胞密度大于108cells/L时,需要对样品进行稀释。样品中浮游植物细胞密度为108cells/L——109cells/L时,样品稀释10倍;样品中浮游植物细胞密度大于109cells/L时,样品稀释100倍。经稀释使加入计数框中的0.1ml样品约含有500个——10000个浮游植物细胞。样品中浮游植物细胞密度的初步判断可参照显微镜计数(8.3.2)进行。对于含有细胞聚集成团的浮游植物样品,当不满足以下两个条件中的任何一个时,稀释前需进行超声波处理:(1)群体中的浮游植物细胞个体较易被辨识,能够对群体中的细胞进行计数;(2)当群体中所含细胞数量与群体体积或长度有固定比例时,如空星藻、盘星藻、丝状藻等,可以将群体作为计数对象,依据比例得到浮游植物细胞数量。超声波处理具体步骤为:取混匀的30ml定量样品于样品瓶(6.5)中,用超声波发生装置(6.6)处理约10min后,在显微镜下进行观察,如仍存在大量未分散的细胞团,则需延长超声波处理时间,直至能够准确计数。根据稀释倍数,选取相应体积的容量瓶,量取不少于25ml混匀后的定量样品或经超声处理后的样品,用水定容至刻线。如要保存稀释后的样品,应注意补充鲁哥氏液,使稀释后样品中的鲁哥氏液浓度与稀释前一致。8.3.2显微镜计数8.3.2.1准备将样品放至室温,用微量移液器(6.7)取0.1ml混匀样品,注入藻类计数框(6.8)中,用盖玻片(6.9)将藻类计数框完全盖住,静置约5min后,开始计数。藻类计数框内应无气泡,如有气泡应重新取样。8.3.2.2选取计数方式根据8.3.1调整后的浮游植物的密度,选用合适的计数方式,使测定过程中浮游植物细胞的总计数量为500个——1500个。表1为推荐选用的计数方式。8.3.2.3计数8.3.2.3.1全片计数方式在40×物镜下,逐一观察藻类计数框中全部100个小方格,分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞,并用计数器(6.10)记录下每行的分类计数结果。若藻细胞体积较大,可降低物镜倍数。8.3.2.3.2行格计数方式在40×物镜下,逐一观察藻类计数框中第2、5、8行,共30个小方格,分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞,并用计数器(6.10)记录下每个小方格的分类计数结果。若藻细胞体积较大,可降低物镜倍数。8.3.2.3.3对角线计数方式在40×物镜下,逐一观察位于藻类计数框对角线位置上的10个小方格,分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞,并用计数器(6.10)记录下每个小方格的分类计数结果。若藻细胞体积较大,可降低物镜倍数。8.3.2.3.4随机视野方式在40×物镜下,随机抽取一定数量的视野,分类计数每个视野内所有浮游植物细胞,并记录下每个视野的分类计数结果。若藻细胞体积较大,可降低物镜倍数。计数前应测量显微镜视野面积,测量方法参见附录B。9结果计算与表示9.1结果计算样品中浮游植物细胞密度(cells/L),按照公式(1)进行计算:9.2结果表示测定结果以科学计数法表示,保留2位有效数字。10精密度6家实验室分别用全片计数、行格计数、对角线计数和随机视野计数对浮游植物密度为1×107cells/L、3×107cells/L、5×107cells/L、1×108cells/L的实际样品进行了7次重复测定,实验室内的相对标准偏差分别为2.4%——11%,2.9%——10%,2.7%——11%,4.8%——8.2%;实验室间相对标准偏差分别为22%、5.6%、7.1%、21%。计算测定结果对数值的95%置信区间,再取反对数得到的实验室间95%置信区间见表2。11质量保证和质量控制11.1浮游植物均匀性在开始显微镜计数前,应确认浮游植物在计数框中分布的均匀性。使用低倍数物镜观察浮游植物在整个计数框中的分布情况,若分布不均匀,应重新取样。11.2最少计数量在单次测定中,浮游植物细胞计数总量不少于500个。当发现测定精度难以达到要求时,可适当增加每次测定中浮游植物细胞的计数总量。11.3精密度控制每一样品测定两次。两次计数结果相对偏差应≤15%,否则应增加计数一次,直至某两次计数结果符合这一要求为止。测定结果为相对偏差≤15%的两次计数结果的平均值。12注意事项12.1如遇到一个浮游植物细胞的一部分在行格或视野内,而另一部分在行格或视野外,在行格上线或视野上半圈的细胞不计数,而在行格下线或视野下半圈的细胞计数。12.2计数过程中,如果发生样品水分蒸发,在计数框中形成气泡,则弃去本片重新取样计数。
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